新霉素致发育中大鼠毛细胞损伤的电镜观察
作者：李华伟 王正敏 沈云珍
单位：上海医科大学眼耳鼻喉科医院(上海200031)
关键词：耳蜗；耳毒性；新霉素；出生后发育；大鼠
听力学及言语疾病杂志990304
【摘要】 目的 应用扫描电镜研究氨基甙类抗生素导致出生后发育过程中大鼠耳蜗毛细胞的损伤病理变化。方法 7天龄SD大鼠肌肉注射80 mg.kg-1.d-1新霉素连续8天，停药后7天处死动物制备样本进行扫描电镜观察。结果 新霉素可造成出生后发育过程中的耳蜗毛细胞严重损伤，表现为底回和钩回三排外毛细胞全部损伤缺失，损伤病变累及顶回的外毛细胞，底回和钩回的内毛细胞出现纤毛脱落和细胞损伤丢失；外毛细胞损伤缺失的部位由顶部具有微绒毛的多边形细胞取代，该细胞形态与胚胎发育早期的毛细胞相似；毛细胞损伤区域未发现再生的毛细胞。结论 出生后发育过程中大鼠耳蜗毛细胞对氨基甙类抗生素的敏感性较高，表面有微绒毛的多边形细胞在毛细胞损伤区域出现提示听觉感觉上皮细胞有再生的倾向。
, http://www.100md.com
SEM Observations of the Cochlear Hair Cell Pathology Induced by Neomycin Ototoxicity During Postnatal Development in Rats
Li Huawei, Wang Zhengmin,Shen Yunzhen.
(EENT Hospital,Shanghai Medical University,200031)
【Abstract】 Objective To study cochlear hair cell pathology induced by Neomycin ototoxicity during postnatal development in rats by means of scanning electron microscopy(SEM).Methods Seven-day-old rats were treated intramuscularly with Neomycin 80 mg.kg-1d-1.. for 8 successive days and were allowed to survive seven days before sacrifice and preparation for observation by SEM.Results Neomycin induced severe damage on cochlear hair cell during postnatal development of rats.Three rows of outer hair cells (OHCs)in the basal turn and hook region were lost and OHCs in apical turn were also affected.The disoriented or partly disappeared stereocilia of inner hair cell(IHC)and loss of IHC were observed in the basal turn and hook region.Epithelium of the former OHC region was replaced by polygonal cells with a tuft of microvilli at their apical surface,which were similar to the early stage of embryonic development of cochlear hair cells.Regenerated hair cells were not found in the damaged region of the sensory epithelia.Conclusion Cochlear hair cells were more sensitive to the ototoxic effects of Neomycin during postnatal development in rats.The polygonal cells toped with a tuft of microvilli appeared in the damaged region indicated that auditory receptors showed an attempt to regenerate.
, 百拇医药
【Key words】 Cochlea Ototoxicity Neomycin Postnatal development Rat
大鼠出生时耳蜗发育尚不完善，出生后1～2周耳蜗结构逐步发育成熟，包括Corti隧道和Nuel间隙形成、毛细胞底部神经末梢分布重建、螺旋神经节细胞分化为Ⅰ型和Ⅱ型神经元、血管纹三层细胞结构形成等结构发育，同时耳蜗功能建立，因此出生后1～2周是耳蜗发育的重要阶段[1～3]。学者们对氨基甙类抗生素导致的成年哺乳动物耳蜗毛细胞损伤进行了深入研究，有了较全面的认识[4]，但氨基甙类抗生素对出生后发育过程中耳蜗毛细胞损伤的研究报道甚少。本研究应用扫描电镜研究新霉素导致的大鼠出生后发育过程中耳蜗毛细胞损伤病理变化的特征，比较其与成年哺乳动物耳蜗毛细胞损伤的差异。
1 材料和方法
选发育正常的7天龄SD大鼠12只，雌雄兼用。10只大鼠于出生后7～14天(连续8天)肌肉注射新霉素(GIBCO公司产品)80 mg.kg-1.d-1于停药后7天处死实验动物。另外2只大鼠作为同期正常对照(处死时为21天龄)。动物断头后，迅速取出二侧听泡，置入2.5%戊二醛中，解剖显微镜下剥除耳蜗骨壁，置上述固定液中过夜(4℃)。标本经0.1M PBS(pH7.2～7.4)漂洗后，1%锇酸后固定2小时用0.1 M PBS(pH7.2～7.4)漂洗 ，解剖显微镜下剥除螺旋韧带、血管纹和盖膜，梯度酒精脱水后，置醋酸异戊酯中。二氧化碳临界点干燥、喷金，HS-520(HITACHI)扫描电镜观察、拍照。
, 百拇医药
2 结果
正常对照大鼠耳蜗三排外毛细胞和一排内毛细胞排列整齐，无纤毛倒状、脱落和毛细胞缺失等现象(图1)。用药组大鼠耳蜗毛细胞出现严重的病理损伤，钩回、底回和部分中回三排外毛细胞全部损伤丢失(图2)，部分顶回的外毛细胞也受累(图3)；钩回和底回局部内毛细胞表现为纤毛紊乱、脱落和毛细胞损伤丢失(图4)，内毛细胞在钩回和底回交界处受损最严重。外毛细胞损伤丢失后，由一种表面具有微绒毛的细胞替代，部分细胞表面形成微绒毛簇，细胞腔面呈五边或六边的多边形，细胞之间界限不明显，此类细胞在底回和中回交界处及中回较明显，其排列与三排外毛细胞相似(图5、6)。损伤缺失的内毛细胞由三角形或梭形表面具有微绒毛的细胞替代(图6)。在耳蜗毛细胞损伤区域未发现新生的发育不成熟的毛细胞。
, 百拇医药
图1 正常对照大鼠耳蜗毛细胞排列整齐，无纤毛紊乱和脱落现象(x1940)
图2 新霉素损伤后幼年大鼠耳蜗底回三排外毛细胞损伤缺失，部分内毛细胞也受损伤(x1760)
图3 损伤范围累及顶回，部分外毛细胞损伤缺失(x1670)
图4 新霉素损伤后幼年大鼠耳蜗底回和钩回交界处三排外毛细胞全部损伤缺夫；内毛细胞纤毛脱落和细胞体由腔面挤出(P) ( x1544)
, 百拇医药
图5 外毛细胞损伤缺失部位由顶部具有微绒毛的多边形细胞替代，部分多边形细胞表面形成微绒毛簇(a)；细胞排列与三排外毛细胞相似(x985)
图6 多边形细胞腔面的微绒毛清晰(a)，细胞间无明显界限。内毛细胞损伤部位由表面有微绒毛的三角形或梭形细胞取代(b)(x2225)3 讨论
本研究在预实验中观察了不同剂量(40、80、120 mg.kg-1.d-1)和用药时间(连续8、10、12天)对成年SD大鼠Corti器毛细胞的损伤，发现肌肉注射新霉素80 mg.kg-1.d-1连续8天可导致底和钩回处外毛细胞纤毛紊乱、倒状、脱落和少数外毛细胞损伤缺失等轻度耳蜗损伤的病理改变，故本文采用了该损伤方案，其目的是为了观察对成年大鼠Corti器毛细胞产生轻度损伤的新霉素剂量和用药时间对出生后发育过程中大鼠Corti器毛细胞的损伤情况。结果显示该药量的新霉素可导致出生后发育过程中的Corti器毛细胞广泛和严重的损害，损伤表现与大剂量系统应用氨基甙类抗生素造成的成年哺乳动物Corti器毛细胞损伤病理变化相似[4]，说明出生后发育1～2周的Corti器毛细胞对新霉素的敏感性高。
, 百拇医药
文中资料在出生后发育阶段大鼠Corti器毛细胞损伤区域未发现新生的幼稚毛细胞，而观察到毛细胞损伤缺失部位由腔面具有微绒毛的多边形细胞替代，此类多边形细胞表面微绒毛的形成与胚胎发育早期观察到的毛细胞表面的微绒毛束相似[5]。成年哺乳动物Corti器毛细胞损伤丢失后由瘢痕组织修复，目前尚未在毛细胞损伤区域发现此类细胞。Romand等[6]对在体和离体幼年大鼠Corti器毛细胞氨基甙类抗生素损伤后修复的研究中发现，这种多边形细胞腔面的微绒毛可以被荧光素标记的鬼笔环肽(Phalloidin)显色，说明微绒毛中含有毛细胞纤毛的主要成分F-肌动蛋白(F-actin)；在离体实验中加入维甲酸(RA)或EGF、TGF-α、TGF-β等生长因子，但没有能够促使此类细胞分化为毛细胞，虽然这种表面有微绒毛的多边形细胞与胚胎发育早期的毛细胞相似，有毛细胞再生修复的倾向，但未发现其分化为毛细胞，他们认为可能与受损伤的Corti器微环境中缺少某种未认识的促分化因子有关。成年哺乳动物前庭毛细胞损伤后，毛细胞损伤区域可见类似的表面具有微绒毛的细胞出现，经过2周的修复，毛细胞损伤区域出现发育不成熟的纤毛，提示这种具有微绒毛的前体细胞分化为毛细胞[7]。大鼠Corti器毛细胞损伤后出现的这种与胚胎发育早期毛细胞相似的多边形细胞参与了感觉上皮的修复，提示生后发育1～2周的大鼠新霉素损伤后Corti器有毛细胞再生修复的倾向，是何种因素阻止此类细胞进一步分化为毛细胞尚不清楚，有待深入研究。
, 百拇医药
综上所述，出生后发育过程中大鼠Corti器毛细胞对新霉素的敏感性较高，新霉素损伤后毛细胞缺失部位由腔面具有微绒毛的多边形细胞取代，该细胞与胚胎发育早期的毛细胞相似，提示毛细胞再生修复的倾向。幼年大鼠Corti器毛细胞损伤后出现的这种具有微绒毛的多边形细胞的来源尚不清楚，推测有二种可能性：①听觉上皮细胞内某种有增殖潜能的细胞再生而来；②由支持细胞的直接转化[6]。进一步研究此类细胞的来源及分化转归对揭示哺乳动物Corti器毛细胞再生有重要意义。
中国博士后科学基金和上海市博士后科研项目联合资助
4 参考文献
1 Shnerson A,Devigne C,Pujol R. Age-related changes in the C57BL/6J mouse cochlea.Ⅱ.Ultrastructural findings.Develop Brain Res,1982,2:77.
, 百拇医药
2 Schwartz AM,Parakkal M and Gully RL. Postnatal development of spiral ganglion cells in the rat, Am J Anat,1983,167:33.
3 Shnerson A,Pujol R.Age-related changes in the C57BL/6J mouse cochlea. Ⅰ.Physiological findings ,Develop Brain Res,1981,2:65.
4 Sullivan MJ,Rarey KE,Conolly RB.Comparative ototoxicity of gentamicin in the guinea pig and two strains of rats.Hear Res ,1987,31:161.
5 Zine AE,Romand R. Development of the auditory receptors of the rat;a SEM study.Brain Res， 1996,721:49.
6 Romand R,Chardin S,Le Calvez S.The spontaneous appearance of hair cell-like cells in the mammalian cochlea following aminoglycoside ototoxicity. Neuroreport,1996,8:133.
7 Rubel EW,Dew LA ,Roberson DW.Mammalian vestibular hair cell regeneration. Science,1995,267:701.
(1998-11-25收稿), http://www.100md.com
单位：上海医科大学眼耳鼻喉科医院(上海200031)
关键词：耳蜗；耳毒性；新霉素；出生后发育；大鼠
听力学及言语疾病杂志990304
【摘要】 目的 应用扫描电镜研究氨基甙类抗生素导致出生后发育过程中大鼠耳蜗毛细胞的损伤病理变化。方法 7天龄SD大鼠肌肉注射80 mg.kg-1.d-1新霉素连续8天，停药后7天处死动物制备样本进行扫描电镜观察。结果 新霉素可造成出生后发育过程中的耳蜗毛细胞严重损伤，表现为底回和钩回三排外毛细胞全部损伤缺失，损伤病变累及顶回的外毛细胞，底回和钩回的内毛细胞出现纤毛脱落和细胞损伤丢失；外毛细胞损伤缺失的部位由顶部具有微绒毛的多边形细胞取代，该细胞形态与胚胎发育早期的毛细胞相似；毛细胞损伤区域未发现再生的毛细胞。结论 出生后发育过程中大鼠耳蜗毛细胞对氨基甙类抗生素的敏感性较高，表面有微绒毛的多边形细胞在毛细胞损伤区域出现提示听觉感觉上皮细胞有再生的倾向。
, http://www.100md.com
SEM Observations of the Cochlear Hair Cell Pathology Induced by Neomycin Ototoxicity During Postnatal Development in Rats
Li Huawei, Wang Zhengmin,Shen Yunzhen.
(EENT Hospital,Shanghai Medical University,200031)
【Abstract】 Objective To study cochlear hair cell pathology induced by Neomycin ototoxicity during postnatal development in rats by means of scanning electron microscopy(SEM).Methods Seven-day-old rats were treated intramuscularly with Neomycin 80 mg.kg-1d-1.. for 8 successive days and were allowed to survive seven days before sacrifice and preparation for observation by SEM.Results Neomycin induced severe damage on cochlear hair cell during postnatal development of rats.Three rows of outer hair cells (OHCs)in the basal turn and hook region were lost and OHCs in apical turn were also affected.The disoriented or partly disappeared stereocilia of inner hair cell(IHC)and loss of IHC were observed in the basal turn and hook region.Epithelium of the former OHC region was replaced by polygonal cells with a tuft of microvilli at their apical surface,which were similar to the early stage of embryonic development of cochlear hair cells.Regenerated hair cells were not found in the damaged region of the sensory epithelia.Conclusion Cochlear hair cells were more sensitive to the ototoxic effects of Neomycin during postnatal development in rats.The polygonal cells toped with a tuft of microvilli appeared in the damaged region indicated that auditory receptors showed an attempt to regenerate.
, 百拇医药
【Key words】 Cochlea Ototoxicity Neomycin Postnatal development Rat
大鼠出生时耳蜗发育尚不完善，出生后1～2周耳蜗结构逐步发育成熟，包括Corti隧道和Nuel间隙形成、毛细胞底部神经末梢分布重建、螺旋神经节细胞分化为Ⅰ型和Ⅱ型神经元、血管纹三层细胞结构形成等结构发育，同时耳蜗功能建立，因此出生后1～2周是耳蜗发育的重要阶段[1～3]。学者们对氨基甙类抗生素导致的成年哺乳动物耳蜗毛细胞损伤进行了深入研究，有了较全面的认识[4]，但氨基甙类抗生素对出生后发育过程中耳蜗毛细胞损伤的研究报道甚少。本研究应用扫描电镜研究新霉素导致的大鼠出生后发育过程中耳蜗毛细胞损伤病理变化的特征，比较其与成年哺乳动物耳蜗毛细胞损伤的差异。
1 材料和方法
选发育正常的7天龄SD大鼠12只，雌雄兼用。10只大鼠于出生后7～14天(连续8天)肌肉注射新霉素(GIBCO公司产品)80 mg.kg-1.d-1于停药后7天处死实验动物。另外2只大鼠作为同期正常对照(处死时为21天龄)。动物断头后，迅速取出二侧听泡，置入2.5%戊二醛中，解剖显微镜下剥除耳蜗骨壁，置上述固定液中过夜(4℃)。标本经0.1M PBS(pH7.2～7.4)漂洗后，1%锇酸后固定2小时用0.1 M PBS(pH7.2～7.4)漂洗 ，解剖显微镜下剥除螺旋韧带、血管纹和盖膜，梯度酒精脱水后，置醋酸异戊酯中。二氧化碳临界点干燥、喷金，HS-520(HITACHI)扫描电镜观察、拍照。
, 百拇医药
2 结果
正常对照大鼠耳蜗三排外毛细胞和一排内毛细胞排列整齐，无纤毛倒状、脱落和毛细胞缺失等现象(图1)。用药组大鼠耳蜗毛细胞出现严重的病理损伤，钩回、底回和部分中回三排外毛细胞全部损伤丢失(图2)，部分顶回的外毛细胞也受累(图3)；钩回和底回局部内毛细胞表现为纤毛紊乱、脱落和毛细胞损伤丢失(图4)，内毛细胞在钩回和底回交界处受损最严重。外毛细胞损伤丢失后，由一种表面具有微绒毛的细胞替代，部分细胞表面形成微绒毛簇，细胞腔面呈五边或六边的多边形，细胞之间界限不明显，此类细胞在底回和中回交界处及中回较明显，其排列与三排外毛细胞相似(图5、6)。损伤缺失的内毛细胞由三角形或梭形表面具有微绒毛的细胞替代(图6)。在耳蜗毛细胞损伤区域未发现新生的发育不成熟的毛细胞。
, 百拇医药
图1 正常对照大鼠耳蜗毛细胞排列整齐，无纤毛紊乱和脱落现象(x1940)
图2 新霉素损伤后幼年大鼠耳蜗底回三排外毛细胞损伤缺失，部分内毛细胞也受损伤(x1760)
图3 损伤范围累及顶回，部分外毛细胞损伤缺失(x1670)
图4 新霉素损伤后幼年大鼠耳蜗底回和钩回交界处三排外毛细胞全部损伤缺夫；内毛细胞纤毛脱落和细胞体由腔面挤出(P) ( x1544)
, 百拇医药
图5 外毛细胞损伤缺失部位由顶部具有微绒毛的多边形细胞替代，部分多边形细胞表面形成微绒毛簇(a)；细胞排列与三排外毛细胞相似(x985)
图6 多边形细胞腔面的微绒毛清晰(a)，细胞间无明显界限。内毛细胞损伤部位由表面有微绒毛的三角形或梭形细胞取代(b)(x2225)3 讨论
本研究在预实验中观察了不同剂量(40、80、120 mg.kg-1.d-1)和用药时间(连续8、10、12天)对成年SD大鼠Corti器毛细胞的损伤，发现肌肉注射新霉素80 mg.kg-1.d-1连续8天可导致底和钩回处外毛细胞纤毛紊乱、倒状、脱落和少数外毛细胞损伤缺失等轻度耳蜗损伤的病理改变，故本文采用了该损伤方案，其目的是为了观察对成年大鼠Corti器毛细胞产生轻度损伤的新霉素剂量和用药时间对出生后发育过程中大鼠Corti器毛细胞的损伤情况。结果显示该药量的新霉素可导致出生后发育过程中的Corti器毛细胞广泛和严重的损害，损伤表现与大剂量系统应用氨基甙类抗生素造成的成年哺乳动物Corti器毛细胞损伤病理变化相似[4]，说明出生后发育1～2周的Corti器毛细胞对新霉素的敏感性高。
, 百拇医药
文中资料在出生后发育阶段大鼠Corti器毛细胞损伤区域未发现新生的幼稚毛细胞，而观察到毛细胞损伤缺失部位由腔面具有微绒毛的多边形细胞替代，此类多边形细胞表面微绒毛的形成与胚胎发育早期观察到的毛细胞表面的微绒毛束相似[5]。成年哺乳动物Corti器毛细胞损伤丢失后由瘢痕组织修复，目前尚未在毛细胞损伤区域发现此类细胞。Romand等[6]对在体和离体幼年大鼠Corti器毛细胞氨基甙类抗生素损伤后修复的研究中发现，这种多边形细胞腔面的微绒毛可以被荧光素标记的鬼笔环肽(Phalloidin)显色，说明微绒毛中含有毛细胞纤毛的主要成分F-肌动蛋白(F-actin)；在离体实验中加入维甲酸(RA)或EGF、TGF-α、TGF-β等生长因子，但没有能够促使此类细胞分化为毛细胞，虽然这种表面有微绒毛的多边形细胞与胚胎发育早期的毛细胞相似，有毛细胞再生修复的倾向，但未发现其分化为毛细胞，他们认为可能与受损伤的Corti器微环境中缺少某种未认识的促分化因子有关。成年哺乳动物前庭毛细胞损伤后，毛细胞损伤区域可见类似的表面具有微绒毛的细胞出现，经过2周的修复，毛细胞损伤区域出现发育不成熟的纤毛，提示这种具有微绒毛的前体细胞分化为毛细胞[7]。大鼠Corti器毛细胞损伤后出现的这种与胚胎发育早期毛细胞相似的多边形细胞参与了感觉上皮的修复，提示生后发育1～2周的大鼠新霉素损伤后Corti器有毛细胞再生修复的倾向，是何种因素阻止此类细胞进一步分化为毛细胞尚不清楚，有待深入研究。
, 百拇医药
综上所述，出生后发育过程中大鼠Corti器毛细胞对新霉素的敏感性较高，新霉素损伤后毛细胞缺失部位由腔面具有微绒毛的多边形细胞取代，该细胞与胚胎发育早期的毛细胞相似，提示毛细胞再生修复的倾向。幼年大鼠Corti器毛细胞损伤后出现的这种具有微绒毛的多边形细胞的来源尚不清楚，推测有二种可能性：①听觉上皮细胞内某种有增殖潜能的细胞再生而来；②由支持细胞的直接转化[6]。进一步研究此类细胞的来源及分化转归对揭示哺乳动物Corti器毛细胞再生有重要意义。
中国博士后科学基金和上海市博士后科研项目联合资助
4 参考文献
1 Shnerson A,Devigne C,Pujol R. Age-related changes in the C57BL/6J mouse cochlea.Ⅱ.Ultrastructural findings.Develop Brain Res,1982,2:77.
, 百拇医药
2 Schwartz AM,Parakkal M and Gully RL. Postnatal development of spiral ganglion cells in the rat, Am J Anat,1983,167:33.
3 Shnerson A,Pujol R.Age-related changes in the C57BL/6J mouse cochlea. Ⅰ.Physiological findings ,Develop Brain Res,1981,2:65.
4 Sullivan MJ,Rarey KE,Conolly RB.Comparative ototoxicity of gentamicin in the guinea pig and two strains of rats.Hear Res ,1987,31:161.
5 Zine AE,Romand R. Development of the auditory receptors of the rat;a SEM study.Brain Res， 1996,721:49.
6 Romand R,Chardin S,Le Calvez S.The spontaneous appearance of hair cell-like cells in the mammalian cochlea following aminoglycoside ototoxicity. Neuroreport,1996,8:133.
7 Rubel EW,Dew LA ,Roberson DW.Mammalian vestibular hair cell regeneration. Science,1995,267:701.
(1998-11-25收稿), http://www.100md.com